Клиентам

Услуги

Сотрудничество

start-up preparation downloads probles equipment  

Подготовка образцов:


1. Номера образцов

Секвенирование ДНК проводится после согласования номеров образцов с сотрудниками ЦКП по телефону в Москве (499) 755-58-18.

2. Поготовка матрицы

Поготовьте фрагмент матрицы ДНК, который необходимо просеквенировать. Это может быть ПЦР-продукт или плазмида. Обязательно проведите гель-электрофорез вашей матрицы, чтобы убедиться в её наличии, качестве и концентрации. Перед тем, как отдать образец на секвенирование, мы рекомендуем переосадить его в мягких условиях для очистки от праймеров и других компонентов ПЦР-реакции, без использования коммерческих наборов. Подробнее о переосаждении и очистке. (протокол переосаждения ).

Для лучшего сиквенса GC-богатых матриц в ЦКП "ГЕНОМ" разработан специальный протокол. Чтобы воспользоваться им следует:
1. Передавать образцы, упаренные в пробирках объемом 0.2 мл.
2. Увеличить количество вносимого на сиквенс праймера до 5pmol на реакцию.
3. Обязательно, отмечайте в примечании к заявке "GC-богатая матрица".

3. Пробирки

Пробирки объемом 0,5 мл, не тонкостенные, предпочтительно фирмы Treff или QSP, должны быть аккуратно и чётко подписаны стойким маркером на крышке и сбоку (без наклеек).

Большие партии могут быть приняты к исполнению в стрипованных пробирках (PCR 8 Strip 0,2 ml)
(подробнее...).

 

Большие партии могут быть приняты к исполнению в плашках для ПЦР (96 Well PCR Plate)

Внимание: Образцы в нестандартных пробирках в исключительных случаях могут быть приняты к исполнению, однако в этом случае мы не гарантируем качество результата.

4. Концентрация матрицы

Следует определить концентрацию матрицы ДНК в каждом образце и разбавить её в соответствии с длиной и типом секвенируемого фрагмента. Придерживайтесь рекомендуемого количества матрицы.

Внимание: Опыт показывает, что превышение допустимого количества матрицы (особенно для PCR-продуктов) резко снижает качество сиквенса. Недостаточное количество матрицы дает слабый флуоресцентный сигнал.

5. Праймер

Стандартное количество праймера, вносимого в каждый образец – 3.2 pmol. При подготовке сложных GC-богатых матриц в пробирках объемом 0.2 мл следует увеличить количество праймера до 5 pmol.

Мы не имеем возможности изменять условия ПЦР, поскольку химия для ПЦР с флуоресцентно-меченными терминаторами (ddNTP) адаптирована к определённым условиям. Учитывайте это при выборе Вашего праймера.

Внимание: Мы не добавляем универсальные праймеры к Вашим плазмидам. Если добавление Вам необходимо, пожалуйста, позвоните нам для согласования этого вопроса.

Внимание: если на электрофорезе у ПЦР-продуктов не видно дополнительных полос, но при секвенировании они получаются гетерогенными на фоне небольшого флуоресцентного сигнала, то вполне вероятно, что проблема связана с неполной очисткой продуктов от ПЦР-праймеров. Для улучшения чтения в подобном случае мы советуем: 1. Уменьшать количество праймеров, вносимых в ПЦР-реакцию (вплоть до 1 пмоль каждого праймера на 10 мкл смеси). 2. Обязательно чистить образцы перед сборкой на сиквенс. 3. Оценивать концентрацию и чистоту ПЦР-продуктов на геле после переосаждения. 4. При подготовке образцов на сиквенс увеличить количество сиквенсного праймера до 15 мкл, при этом не превышать рекомендованное количество матрицы (лучше держаться нижней границы).

6. Упаривание

Образцы следует полностью упарить в вакуумной центрифуге или в термостате на 60-65°С. При упаривании в термостате рекомендуем выдержать пробирки 5-10 мин. при комнатной температуре, чтобы избежать выпадения конденсата. Крайне желательно, чтобы объем упариваемого образца не превышал 10 мкл.

При упаривании важно не пересушивать матрицу.

Внимание: Мы не гарантируем качество сиквенса неполностью упаренных образцов. Мы не принимаем образцы, содержащие красители или иные посторонние вещества.

7. Заявка

Заполните и подпишите у грантодержателя Заявку на секвенирование. При необходимости, заполните графу "примечания".

В случае GC-богатой матрицы следует указать это в примечаниях.
Укажите, если у Вас срочные клинические образцы.

8. Доставка образцов

Упаренные образцы для секвенирования в запечатанных и подписанных конвертах или прозрачных папках вместе с приложенным бланком аккуратно заполненной и подписанной Заявки просим оставлять на вахте института молекулярной биологии в папке ЦКП «Геном». Образцы привозить в день записи вечером до 22:00 или утром следующего дня до 10:30.

Внимание: Работает бесплатная курьерская доставка образцов с вахт ИБХ РАН и корпуса "Б" МГУ им. М.В. Ломоносова. Чтобы воспользоваться услугой, закажите доставку по телефону одновременно с согласованием номеров образцов.

Курьерская доставка (требуется предзаказ по телефону):

Из корпуса "Б" МГУ им. М.В. Ломоносова (папка ЦКП "ГЕНОМ" на вахте).

Из Института Биоорганической Химии РАН (папка ЦКП "ГЕНОМ" на вахте).

9. Получение результатов

Мы выполняем анализ Ваших образцов в течение 1-3 рабочих дней и высылаем результаты в виде электрофореграмм (формат .ab1) по электронной почте, указанной Вами в Заявке на секвенирование.

Внимание: Если прошло более 2-3 рабочих дней, а Вы не получили результаты, пожалуйста, позвоните нам по телефону или напишите по электронной почте (zkpg@yandex.ru)!

Внимание: мы высылаем электрофореграммы в формате .ab1. Некоторые программы (например, старые версии SeqMan) не могут открывать напрямую данные, полученные с нового секвенатора 3500xL. В этом случае целесообразно конвертировать формат .ab1 в более универсальный .scf. Это можно сделать через опцию «Batch conversion» в таких программах, как Chromas или BioEdit.
    client