 |
 |
 |
 |
 |
Ошибки и проблемы
при секвенировании:
Коллеги!Основные проблемы в секвенировании связаны с качеством матрицы. Обычно вы (и только Вы!) можете САМОСТОЯТЕЛЬНО определить причину неудачи, внимательно анализируя и сравнивая сиквенсы образцов из своей партии или с прошлыми партиями. Опорой для этого сравнения служит прилагаемый сиквенс контрольной плазмиды, ДНК которой вместе с вашей партией образцов прошла все этапы секвенирования и последующего анализа в приборе. АНАЛИЗ ПРИЧИН НЕУДАЧ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
ПРИМЕРЫ ТИПОВЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ МАТРИЦЫ ДНК (фрагменты хроматограмм)1. Хороший сиквенс («сигнал норма»). |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1. Хороший сиквенс («сигнал норма»)Хроматограмма хорошо подготовленной матрицы ДНК правильной концентрации не несёт посторонних сигналов, читается далеко (вплоть до 700-900 п.н. на секвенаторе ABI PRISM 3730), пики на ней примерно одинаковой высоты, шум прибора не виден.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2. Сиквенс с высоким фоновым приборным шумом («слабый сигнал»)Основной сигнал чтения матрицы ДНК на хроматограмме идёт на фоне более или менее выраженного шума прибора, что является следствием недостаточного количества матрицы в образце. В ряде случаев результаты такого сиквенса могут быть использованы в работе, шум прибора следует просто игнорировать и не путать его с настоящей гетерогенностью матрицы. Правильная концентрация матрицы в образце – необходимое условие успешного сиквенса.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3. Непрошедший сиквенс («сигнал на уровне шума прибора»)В отсутствие хоть сколько-нибудь выраженных пиков на хроматограмме отображается только шум прибора. Подобная ситуация может быть связана со следующими причинами:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Гетерогенная матрицаНа хроматограмме основной сигнал чтения матрицы ДНК идёт на фоне более или менее выраженного второго сигнала или даже нескольких сигналов. Иногда он полностью замаскирован и не может быть выделен. Причиной гетерогенности является присутствие в образце нескольких матриц ДНК. Чаще всего такая проблема встречается в ПЦР-продуктах и является следствием неспецифичной посадки праймера на матрицу ДНК (например, в результате его вырожденности или неподходящих условий ПЦР-реакции). Наиболее очевидным решением является прочтение матрицы с обратного праймера (F/R) или же подбор другого праймера.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Преждевременный обрыв сиквенса в GC-богатой матрицеНа хроматограмме видна резкая остановка сиквенса после GC-богатого участка. В целом, GC-богатые участки более тугоплавкие, и матрица, содержащая много таких нуклеотидных пар, более сложна для исследования. В ряде случаев они образуют вторичных структур (шпилек) из-за самокомплементарности участков матрицы ДНК, что приводит к невозможности дальнейшего прочтения. Решением проблемы может стать чтение матрицы с обратного праймера либо замена праймера, в ряде случаев помогает проведение ПЦР с флуоресцентно-меченными терминаторами (ddNTP) при повышенной температуре денатурации.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
6. Резкое падение высоты пиков (величины сигнала)В целом качество прочтения матрицы хорошее и величина сигнала в норме, однако в анализируемой смеси присутствует большое количество фрагментов короткой длины, длинных же сравнительно мало. Причиной может быть наличие в области «перепада высот» вторичной структуры (шпильки), или же сложного участка, который плохо проходит полимераза. В этом случае можно попробовать прочитать с другого конца. В ряде случаев помогает проведение ПЦР с флуоресцентно-меченными терминаторами (ddNTP) при повышенной температуре денатурации.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
7. Перегрузка короткими фрагментами (быстрое падение сигнала)В самом начале на хроматограмме видны высокие «обрезанные» сверху пики. Далее высота пиков резко снижается, что приводит к короткому прочтению матрицы. Обрезанные пики указывают на перегрузку анализируемой матрицы короткими фрагментами, при наработке которых в процессе ПЦР израсходовалось слишком много флуоресцентно-меченных терминаторов (ddNTP), в результате их не хватило для амплификации более длинных фрагментов. Особенно часто подобная проблема встречается для матриц с GC-богатым началом. Стоит более точно определять концентрацию матрицы. Для GC-богатой матрицы можно повысить температуру денатурации.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
8. Сбой после сложного участкаНа хроматограмме после сложного участка матрицы ДНК (различные мотивы, poly-A, poly-C, poly-G, poly-T) теряется чёткость прочтения, сиквенс далее выглядит гетерогенным. При прохождении сложного участка произошел сбой работы полимеразы. Самым простым решением будет прочтение недостающего отрезка матрицы с другой стороны (с обратного праймера).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
9. Димеры праймеровВ начале хроматограммы наблюдается перегрузка короткими фрагментами матрицы (20-40 п.н.), далее высота пиков резко снижается. Такая картина указывает на присутствие в анализируемом образце большого количества димеров праймеров, образовавшихся в результате их частичной комплементарности при проведении ПЦР на стадии подготовки образца. Решением является разработка другой системы праймеров или же качественная очистка матрицы на стадии подготовки образца к сиквенсу (например, вырезание фрагмента, содержащего только основной продукт ПЦР, из агарозного геля и его очистка).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10. Появление дополнительных пиков («n-x сдвиг»)На хроматограмме помимо основного продукта виден второй продукт, практически идентичный, но с отставанием в 1 (иногда 2, 3, …) нуклеотид. Причиной такого сдвига является частичное распадение праймера, вызывающее наработку 2 продуктов. Например, праймер ABCDE- нарабатывает последовательность ABCDE-FGHI…., праймер, от которого «отвалился» один нуклеотид, приводит к появлению продукта BCDE-FGHI… На форезе видим два почти одинаковых продукта с отставанием в 1 нуклеотид (иногда более). Решение - заменить праймер или игнорировать факультативный продукт.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
11. Загрязненная матрицаПики на хроматограмме слева имеют крутые края, а справа - пологие. Эта пологость свидетельствует о загрязнённости матрицы побочными веществами (например, солями). Для того чтобы избавиться от этой проблемы, следует переосадить матрицу спирт-ацетатным методом (скачать методику).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
12. Появление несвязавшихся во время ПЦР-реакции флюоресцентно-меченных терминаторовНа хроматограмме в начале есть два «пузыря» (первый выше, второй ниже), состоящих из линий всех четырёх цветов. Это несвязавшиеся во время ПЦР-реакции флюоресцентно-меченные терминаторы (unincorporated dye terminators), неполностью удаленные во время спирто-ацетатного переосаждения матрицы. Причинами того, что не все несвязавшиеся терминаторы были удалены в большей степени связаны с неоптимальными условиями переосаждения. При сиквенсе матрицы оптимальной концентрации «пузыри» несвязавшихся терминаторов выражены слабо и не портят результат анализа, однако при недостаточной концентрации матрицы они относительно более высокие и маскируют собой несколько нуклеотидов, создавая дефект хроматограммы.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
13. Появление в произвольном месте узкого и высокого пикаПоявление в произвольном месте узкого и высокого пика шириной в 1-2 нуклеотида всех четырёх цветов представляет собой дефект электрофореза данного образца, вызванный попаданием в капилляр кристалла полимера. Повторный электрофорез того же образца, который в подобном случае выполняется бесплатно по запросу, полностью исправляет данный дефект.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
14. Задержанное началоНа хроматограмме отсутствуют нормальные пики, в ряде случаев постепенно начинается чтение, но оно как бы растянуто и не соответствует настоящей последовательности нуклеотидов в матрице. Причиной такого дефекта электрофореза является задержка электроинъекции данного образца в капилляр секвенатора. Повторный форез образца (в подобном случае выполняется бесплатно) чаще всего исправляет данный дефект. В раде случаев причиной задержанного начала является загрязнённость матрицы солями. В этом случае повторный форез не улучшает ситуацию.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1. Хороший сиквенс («сигнал норма»). |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 |