Часто задаваемые вопросы:
Мне не ясны комментарии к результатам. Что означает, «сигнал норма», «сигнал слабый» и т.д. К чему это относится?
Флуоресцентно-меченные фрагменты ДНК при прохождении капиллярного электрофореза в секвенаторе испускают свет, который регистрируется и интерпретируется компьютерной программой как определённые нуклеотиды. В целом, интенсивность этого сигнала говорит о количестве наработанных в процессе ПЦР фрагментов данной длины. То есть в случае правильной концентрации исходной матрицы ДНК сигнал попадает в средний диапазон величин («сигнал норма»). Если сиквенс образца прошёл, но величина флуоресцентного сигнала невелика, в силу чего становится виден так называемый «шум прибора» внизу хроматограммы (который можно принять за некую гетерогенность), то это «слабый сигнал». Если на хроматограмме вообще не регистрируются пики – «сигнал на уровне шума прибора».
Чтобы получить больше информации об успешности прохождения электрофореза Ваших образцов (в том числе, и о величине флуоресцентного сигнала), Вы можете скачать бесплатную программу Sequence Scanner.
Можно ли попросить вас при подготовке проб к секвенированию изменить условия ПЦР, в частности, температуру отжига праймеров?
Поскольку мы работаем с фирменным набором реактивов (BigDye® Terminator), мы не имеем возможности менять температуру отжига праймера, она стандартная и составляет 50 градусов. Как правило, это не приводит к появлению дополнительных мест посадки праймера, так как мы работаем с небольшим по длине ПЦР-фрагментом Вашей матрицы.
Я работаю со сложной GC-богатой матрицей, можете ли вы что-то предложить для улучшения качества чтения?
Для лучшего сиквенса GC-богатых матриц в ЦКП "ГЕНОМ" разработан специальный протокол. Чтобы воспользоваться им следует:
1. Передавать образцы, упаренные в пробирках объемом 0.2 мл.
2. Увеличить количество вносимого на сиквенс праймера до 5pmol на реакцию.
3. Обязательно, отмечайте в примечании к заявке "GC-богатая матрица".
Мы несколько лет не пользовались услугами ЦКП, но у нас оставалось некоторое количество оплаченных сиквенсов. Можем ли мы реализовать их или надо оплачивать новый счет?
Вне зависимости от того, как давно Вы оплачивали реакции, можно реализовать оставшееся количество сиквенсов.
Мне необходимо сделать сиквенс совсем не большого числа образцов, как мне поступить?
Если Ваша работа не предполагает большого числа сиквенсов, то наиболее рационально найти в Вашей организации грантодержателя, который уже пользуется услугами ЦКП, и договориться о секвенировании необходимого числа образцов через него в качестве исполнителя. Если Вы не знаете, к кому можно обратиться в вашей организации, позвоните нам по телефону или напишите письмо.
Можно ли как-то ускорить получение результатов?
В случае, если для Вас важно срочное получение результатов анализа (например, при диагностике заболеваний), указывайте это на бланке заявки и конверте с образцами. Они будут проанализированы и высланы Вам максимально быстро.
У нас гетерогенная матрица. Как нам получить хороший сиквенс?
Наиболее частые причины гетерогенного сиквенса:
1. Неспецифическая посадка праймеров. Проверьте гомогенность Вашей матрицы методом электрофореза. Для более четких результатов используйте плотный гель (агароза 1,5-2%) и увеличенное время разгонки (не менее 1 часа). При выявлении нескольких продуктов, вырежте целевой продукт и очистите его. Возможно повысить специфичность работы праймеров, оптимизировав условия ПЦР-реакции, или же заменить праймеры.
2. Присутствие в пробе остатков праймеров. Результатом подобной ошибки будет гетерогенный сиквенс при том, что на электрофорезе видна одна четкая полоса. Используйте коммерческие наборы для очистки или же используйте переосаждение ацетатом аммония в мягких условиях.
3. Контаминация матрицы. Проверьте чистоту выделения ДНК, чистоту культур и т.д.
Подробнее смотрите в специальном разделе.